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1. WO2021006490 - COSMETIC COMPOSITION CONTAINING GRAPHENE QUANTUM DOTS AS ACTIVE INGREDIENT

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명세서

발명의 명칭

기술분야

1   2   3  

배경기술

4   5   6   7   8   9   10   11   12  

발명의 상세한 설명

기술적 과제

13   14  

과제 해결 수단

15   16   17   18   19   20   21   22  

발명의 효과

23   24  

도면의 간단한 설명

25   26   27   28   29   30   31   32   33   34  

발명의 실시를 위한 형태

35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80   81   82   83   84   85   86   87   88   89   90   91   92   93   94   95   96   97   98   99   100   101   102   103   104   105   106   107   108   109   110   111   112   113   114   115   116   117   118   119  

청구범위

1   2   3   4   5   6   7  

도면

1   2   3   4a   4b   5   6   7   8   9  

명세서

발명의 명칭 : 그래핀 양자점을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

기술분야

[1]
본 발명은 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 그래핀 양자점을 유효성분으로 함유하는 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화용 화장료 조성물에 관한 것이다.
[2]
본 발명은 또한, 그래핀 양자점을 유효성분으로 함유하는 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화용 의약외품 조성물, 약학 조성물에 관한 것이다.
[3]

배경기술

[4]
신체 중 피부는, 외부 환경과 직접 접하면서 다양한 유해 인자로부터 몸을 보호하는 기능을 담당하고 있다. 노화는 나이가 들면서 자연스럽게 진행되는 현상으로, 복잡한 인체 메커니즘에 의한 결과로서 본래 가지고 있는 정상적인 기능이 생리학적으로 점차 쇠퇴하는 것을 일컫는다. 노화는 다양한 자극에 의해서 촉진되거나 감소될 수 있으나, 현대 사회에 접어들면서 자외선, 환경 오염, 스트레스 등의 내외부적 요인으로 인해 가속화되고 있다.
[5]
피부는 외부에서부터 순서대로 표피(Epidermis), 진피(Dermis), 피하지방(Hypodermis) 조직의 3개 층으로 크게 구분되며, 물리적, 화학적인 외부 환경의 자극으로부터 인체를 보호하는 기능을 한다. 이 중 표피는 다시 각질층, 과립층, 유극층, 기저층으로 나뉘는데, 각질층은 약 10~20%의 수분을 함유하며 인체의 최외곽에 존재함으로써 체외로의 수분 증발을 억제하는 한편 외부로부터의 물질 과잉 침투를 차단하는 역할을 한다. 각질층 표면은 피지선에서 나온 피지와 땀샘에서 나온 땀으로 만들어진 얇은 천연 보호막으로 감싸져 있어 수분의 증발을 예방한다. 한편, 진피층은 피부의 지지대 역할을 하는 콜라겐(Collagen)과 탄력을 형성하는 피브릴린(Fibrillin) 등의 단백질 등을 합성하여, 피부의 탄력을 유지하고 구조를 지지하는 역할을 한다.
[6]
[7]
피부의 노화는 각질층의 수분 부족이나 진피층의 세포외 기질 단백질의 이상으로 인해 발생하며, 노화가 진행될수록 피부를 구성하는 물질인 콜라겐, 엘라스틴, 히알루론산 및 당단백질 등의 함유량 및 배열이 변하거나 감소하는 증상들이 나타난다. 표피의 각질층을 구성하고 있는 세포에는 수용성 성분인 고농도의 천연보습인자(Natural Moisturizing Factor; NMF)가 존재하여 각질층의 수분 유지에 중심적인 역할을 한다. 아미노산, 당류와 같은 천연보습인자는 피부가 유연성을 나타내도록 작용함은 물론 적절한 수분을 유지할 수 있도록 돕는다. 특히 아미노산과 같은 물질은 그 자체로 수용성일 뿐만 아니라 효과적으로 수분과 결합하여 피부에서 수분이 건조되는 것을 억제한다. 이러한 각질층의 수분이 감소하면, 피부가 건조해지고 표면이 거칠어지며 피부가 윤기를 잃어 칙칙하게 보이는 등의 현상이 발생하기 때문에 피부 보습제의 필요가 증가하고 있다.
[8]
아쿠아포린(Aquaporin)은 물 분자만을 선택적으로 통과시키며 모든 세포막에 존재하는 막관통단백질(Major Intrinsic Protein Family)로, 피부의 수분 흡수를 증가시킨다. 포유동물에서 발견되는 아쿠아포린은 13개의 동종 단백질(AQP-1 내지 AQP-13)이고, 이들 중 아쿠아포린-3(Aquaporin-3, AQP-3)은 사람의 표피에 풍부하게 존재한다. 아쿠아포린-3은 피부의 각질형성세포에서 발현하며, 아쿠아포린-3을 통한 물 및 글리세롤의 흡수와 이동은 세포의 수분 손실을 방지해 피부의 보습 및 탄력을 증가시킨다.
[9]
또한, 노화된 피부에서 나타나는 주름살과 피부의 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등은 대부분 진피에 존재하는 기질단백질의 변화 때문이다. 진피는 피부 내에서 피부의 강도와 형태를 지지하는 역할을 하고 있기 때문에 노화가 진행될 때 진피에 형태적인 변화가 일어나게 되면 주름 생성 및 피부 쳐짐에 결정적인 역할을 하게 된다. 이러한 기질단백질을 분해하는 효소로서 대표적인 것이 매트릭스 메탈로프로테아제(Matrix metalloproteinase, MMP)이다. 자외선 조사 시 피부 내의 MMPs 활성이 증가되고, 피부 내의 콜라겐 및 기타 기질단백질을 현저하게 분해시켜 피부 노화를 촉진하는데 주요한 요인으로 작용한다. 그 중 콜라게나아제(Collagenase)로 알려진 MMP-1은 피부 콜라겐 쇠퇴에 가장 영향을 끼치는 효소 중 하나이다. 따라서 MMP-1을 억제하는 활성 성분은 피부 노화 방지에 좋은 효과를 갖는다.
[10]
[11]
이에, 본 발명자들은 바이오 분야에 적용 가능한 그래핀에 주목하여, 본 발명을 완성하게 되었다. 그래핀은 탄소 원자가 sp 2 혼성 결합을 통해 육각형 격자구조를 이루어 만들어진 원자 한 층의 2차원 물질이다. 그래핀이 처음 발견된 후 그래핀의 특이한 물리적, 화학적, 전기적 그리고 기계적 특성을 이용한 다양한 연구가 진행되어 왔으며, 최근에는 그래핀 유래 나노 물질들의 바이오 분야 응용 가능성에 주목하면서 바이오 소재로 적용시키는 연구가 활발히 보고되고 있다. 종래 그래핀을 함유한 화장료로서, 그래핀 양자점을 함유하여 자외선 흡수 기능을 증진시킨 화장료 조성물(KR 10-1710907B)이 개시된 바 있다.
[12]

발명의 상세한 설명

기술적 과제

[13]
본 발명은 그래핀 양자점을 유효성분으로 함유하는 조성물을 통해 피부 재생, 주름 개선, 보습, 항산화 효과를 제공하는 것을 목적으로 한다.
[14]

과제 해결 수단

[15]
본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여, 그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
[16]
본 발명은 또한, 전체 화장료 조성물 총 중량 대비 그래핀 양자점을 1.0 × 10 -7 내지 30 중량%로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
[17]
본 발명의 그래핀 양자점은 i) 활성산소 소거, ii) 콜라게나아제(MMP-1)의 발현 억제, iii) 타입 1 프로콜라겐(type 1 procollagen) 합성 촉진, iv) 피브릴린(fibrillin) 발현 증가, v) 히알루론산 합성 효소(HAS-3) 발현 증가, 또는 vi) 아쿠아포린-3(AQP-3) 발현 증가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효과를 제공하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
[18]
본 발명은 또한, 분체(powder), 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 향료, 친수성 또는 친유성 활성제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
[19]
본 발명은 토너제, 로션제, 및 크림제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
[20]
본 발명의 다른 구현 예로서, 그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는, 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화용 의약외품 조성물을 제공한다.
[21]
본 발명의 또 다른 구현 예로서, 그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는, 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화용 약학 조성물을 제공한다.
[22]

발명의 효과

[23]
본 발명에 따른 그래핀 양자점을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물, 의약외품 조성물 또는 약학 조성물은 피부 재생, 주름 개선, 보습, 항산화 효과를 나타낸다.
[24]

도면의 간단한 설명

[25]
도 1은 섬유아세포에 그래핀 양자점(Graphene Quantum Dots, GQD)을 각각 100 ng/mL, 1000 ng/mL, 1x10 4 ng/mL, 1x10 5 ng/mL 처리 시, 세포 활성 저해에 영향을 미치지 않음을 나타내는 그래프이다.
[26]
도 2는 섬유아세포에 그래핀 양자점을 각각 100 ng/mL, 1000 ng/mL 처리 시, H 2O 2로 유발된 세포 내 활성 산소 제거능을 나타내는 그래프이다.
[27]
도 3은 섬유아세포에 그래핀 양자점을 10 ng/mL, 100 ng/mL, 1000 ng/mL 처리 시, H 2O 2로 유발된 활성 산소 중 OH 라디칼 소거능을 나타내는 형광 이미지이다.
[28]
도 4는 그래핀 양자점을 10 ng/mL, 100 ng/mL, 1000 ng/mL 처리 시, 농도가 증가함에 따른 섬유아세포의 재생 촉진 효과를 나타내는 이미지이다.
[29]
도 5는 그래핀 양자점의 UV 조사로 인해 증가한 MMP-1 발현 억제 효과를 측정한 그래프이다.
[30]
도 6은 그래핀 양자점 처리 시, 콜라겐 합성 효소 COL1A1 발현 촉진 효과를 나타내는 그래프이다.
[31]
도 7은 그래핀 양자점 처리 시, 피브릴린(Fibrillin) 발현 촉진 효과를 나타내는 그래프이다.
[32]
도 8은 그래핀 양자점 처리 시, 히알루론산 합성 효소인 HAS-3 발현 촉진 효과를 나타내는 그래프이다.
[33]
도 9는 그래핀 양자점 처리 시, 아쿠아포린-3(AQP-3) 발현 촉진 효과를 나타내는 그래프이다.
[34]

발명의 실시를 위한 형태

[35]
본 발명자들은 그래핀 양자점(Graphene Quantum Dots, GQD)이 피부 세포에 독성이 없는 것을 확인하였고, 피부 섬유아세포의 재생을 촉진시키는 효능을 확인하였다. 또한, 피부 세포 내 생성된 활성산소 제거능을 보이며, 콜라게나아제(MMP-1) 발현을 억제하고 COL1A1 및 피브릴린(Fibrillin) 발현을 촉진하는 것을 통해 항산화 및 주름 개선 효과가 있는 것을 확인하였다. 또한, 피부 보습 인자인 히알루론산 합성 유전자 HAS-3(Hyaluronan Synthase-3)과 아쿠아포린-3(Aquaporin-3, AQP-3) 발현 증가를 통해 그래핀 양자점의 보습 효과를 확인하였다. 결과적으로 본 발명은 재생, 항산화 및 보습을 통해 항노화 효과를 갖는 그래핀 양자점을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.
[36]
[37]
본 명세서 내에서, "노화"는 나이가 듦에 따른 노화(chronoaging), 또는 태양에의 노출에 따른 노화(광노화), 극한 기후 조건, 담배 연기, 미세먼지, 화학적 오염 물질 등으로 인한 환경 요인에의 노출을 통해 피부가 경험하는 모든 변화를 의미한다. 노화로 인한 피부의 변화는 촉감 등을 통한 외적인, 가시적인 및/또는 인식가능한 모든 변화, 또는 피부 조직의 조직학적 변화를 포함한다. 노화는 다양한 요인에 의해 발생할 수 있는 것으로, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 재생, 주름 개선, 보습, 및 항산화를 통해 다양한 기작으로 피부의 항노화에 도움을 줄 수 있다.
[38]
본 명세서 내 "피부 광노화(Photo aging)"는 일광노출(자외선)에 의해 피부가 노화되는 현상을 의미하는 것으로서, 장기간동안 태양(자외선)에 노출되면, 얼굴, 목에 깊은 주름을 증가시키고 또 피부의 건조 및 피부 표면이 거칠어지거나 반점, 주근깨 등의 색소침착을 일으킨다.
[39]
본 명세서 내에서 "세포"는 피부 세포를 의미하며, 예로서 표피에 존재하는 각질 형성 세포(Keratinocyte) 및 멜라닌 세포 (Melanocyte), 진피에 존재하며 콜라겐(Collagen) 및 엘라스틴(Elastin)의 생합성을 담당하는 섬유아세포(Fibroblast)를 들 수 있다. 상기 피부 세포는 바람직하게는 섬유아세포일 수 있다.
[40]
본 명세서 내 "피부 주름 개선"은 피부의 주름 및 탄력과 관련된 능력을 유지 또는 강화시키는 것을 의미한다. 피부 진피층의 교원섬유인 콜라겐(collagen)과 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)이 그러한 역할을 하는 주요 단백질로서 피부 탄력을 주관하는데, 콜라겐의 생합성은 피부의 내, 외적 영향을 받게 된다. 구체적으로, 피부 세포는 자연 노화로 인하여 세포 활성이 감소되면 콜라겐 섬유의 감소가 일어나거나, 또는 외적 요인으로서 자외선이 과량 조사되거나 스트레스 등에 의해 생성된 활성 산소가 단백질의 티올기(thiol: -SH)와 반응하여 효소 활성을 저해하거나, 콜라겐, 엘라스틴 등의 분해 효소의 발현을 증가시켜 피부의 주름을 증가시키고 탄력을 감소시켜 피부 노화가 진행된다.
[41]
본 명세서에 있어서, "재생"은 손상된 부위의 기능이 회복되는 것을 의미한다. 일 예로, 상기 재생은 세포의 직접적인 공급으로 훼손된 기관의 조직이 정상적인 기능을 하게 하는 세포 치료 방법과 세포외 생리활성물질의 공급으로 기능회복을 돕는 방법을 포함한다.
[42]
본 명세서 내에서 "항산화"는 인체 내 산화적 손상을 일으키는 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)을 소거하는 것을 의미한다. 활성산소종은 자외선 조사 시 다량 발생되어 DNA, RNA, 단백질, 세포막 및 세포 구조에 손상을 입히므로 노화의 주원인 중 하나로 고려된다.
[43]
본 명세서의 "보습"은 피부 각질 세포 등의 수분 함량을 적절히 유지하도록 하여, 탄력 감소 및 피부 건조화를 막고 표면이 거칠게 되는 것을 방지하는 것을 의미한다.
[44]
본 명세서에서 "그래핀 양자점(Graphene Quantum Dots, GQD)"은 도체물질인 그래핀을 반도체 형태로 만들기 위해 10 nm 이하의 크기로 만든 물질을 의미한다. 본 명세서 내에서 약어 GQD로 사용되기도 한다. 그래핀 양자점은 그 작은 크기로 인해 여러 측면에서 우수한 효과를 나타낼 수 있다. 그래핀 유래 나노 물질들은 대량합성이 용이 하고, 합성 후 처리를 통해 물질의 크기, 표면 전하 등을 변형시킬 수 있다. 또한 넓은 표면적을 가지고 있으며, 필요에 따라 다른 물질을 부착 하기에도 용이 하기 때문에 바이오 소재로의 많은 잠재력을 가지고 있다.
[45]
[46]
이하, 상기 화장료 조성물에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
[47]
[48]
본 발명의 화장료 조성물은, 그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는 피부 재생, 보습 또는 항산화용 화장료 조성물이다.
[49]
본 발명의 화장료 조성물은, 그래핀 양자점을 조성물 총 중량에 대하여 1.0 × 10 -7 내지 30 중량%로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 유효성분인 그래핀 양자점의 함량이 1.0 × 10 -7 중량% 미만이면 피부 재생, 보습 또는 항산화 효과가 미미하고, 30 중량%를 초과하면 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않기 때문이다.
[50]
[51]
그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은, 세포 독성이 없으며, 피부 세포에 처리한 결과 피부 재생, 주름 개선, 보습, 항산화 효과를 보이는 화장료 조성물로써 제공 가능하다. 본 발명 화장료 조성물의 유효성분인 그래핀 양자점은 섬유아세포의 활성산소, 그 중에서도 특히 OH 라디칼을 효과적으로 소거함으로써 피부 항산화 효과를 제공하며, 섬유아세포의 재생을 촉진하고 피부 콜라겐 분해 효소인 콜라게나아제(MMP-1)의 발현을 억제하며, 타입 1 프로콜라겐 및 피브릴린 합성을 촉진함으로써 주름 개선 효과를 나타낸다. 또한, HAS-3 및/또는 AQP-3의 발현을 촉진함으로써 보습 효과를 나타낸다. 따라서 피부 노화를 방지하는 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
[52]
[53]
본 발명의 화장료 조성물은 분체(Powder), 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(Foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 향료, 친수성 또는 친유성 활성제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상, 또는 화장품에 통상적으로 사용 되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 또는 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품 또는 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다. 또한, 본 발명의 조성물은 피부 개선 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.
[54]
[55]
본 발명의 화장료 조성물은 또한, 토너제, 로션제 및 크림제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 형태로 제형화될 수 있으며, 그 제형이 특별히 한정되는 것은 아니다.
[56]
[57]
다른 양상으로서 본 발명은, 그래핀 양자점을 유효성분으로 함유하는 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화용 의약외품 조성물을 제공한다. 본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 의미한다.
[58]
본 발명의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
[59]
본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 바디 클렌저, 소독 청결제, 세정제, 주방용 세정제, 청소용 세정제, 치약, 가글제, 물티슈, 세제, 비누, 핸드 워시, 헤어 세정제, 헤어 유연제, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 및 필터충진제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 제형일 수 있다. 본 발명의 의약외품 조성물에는 제형에 따른 차이점을 제외하고는, 상기 화장료 조성물에 대하여 설명한 바와 동일한 내용이 적용될 수 있다.
[60]
[61]
또 다른 양상으로서 본 발명은, 그래핀 양자점을 유효성분으로 함유하는 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 투여량은 투여 대상의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 정도, 약물의 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 적절히 선택될 수 있다.
[62]
[63]
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 분화 세포를 제조하는 방법은, 배아줄기세포로부터 유래된 배상체를 계대 배양하여 분화 세포를 형성하는 단계; 상기 분화 세포의 성장을 억제시키면서 상기 분화 세포를 배양하는 단계; 및 상기 분화 세포의 배양 단계로부터 용액 성분을 회수하는 단계를 포함한다.
[64]
[65]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[66]
[67]
< 실시예 1>
[68]
제조예 1: 그래핀 양자점의 제조
[69]
본 실험에 사용된 그래핀 양자점(Graphene Quantum Dots, GQD)은 2018년 Nature Nanotechnology 에 발표된 논문[ Nat. Nanotech. 3, 812-818 (2018)]을 참고하여 제조하였다. 황산과 질산이 3 : 1 부피 비율로 섞인 용액에 카본 파이버(Carbon fiber)를 넣은 후 80 ℃에서 24시간 동안 교반하며 가열한다. 이후 산 제거와 진공 여과를 통해 정제하고 수분을 제거하여 파우더 형태의 그래핀양자점을 수득한다. 이렇게 제조한 그래핀양자점은 20 나노미터 이하의 다양한 크기를 가질 수 있으며, 본 실험에 사용된 그래핀 양자점은 약 3 나노미터 수준이다.
[70]
위와 같이 얻은 그래핀 양자점 분말은 하기 실험예 1 ~ 7에서 세포 효능 평가를 위해, Dulbecco's phosphate buffered saline(DPBS)에 농도별로 분산시켜 사용하였다.
[71]
[72]
실험예 1 : 세포 독성 평가
[73]
실시예 1의 그래핀 양자점의 세포 독성 평가를 위해 사람의 섬유아세포 세포주(Human dermal fibroblast, Hs68)에서의 세포수 변화를 측정하였다. Epigallocatechin gallate(EGCG)를 처리한 세포를 양성 대조군으로 사용하였다.
[74]
먼저 Hs68 섬유아세포를 96 well plate에 2x10 4의 수만큼 분주한 후, 37 ℃, 5% CO 2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 그래핀 양자점(GQD)을 포함하지 않은 배지(None)와 그래핀 양자점을 각각 100 ng/mL, 1000 ng/mL, 1x10 4 ng/mL, 1x10 5 ng/mL 포함하는 배지로 교체해 준 다음, 24시간 동안 추가로 배양하였다. 24시간 후 각 well의 배지를 제거하고 Dulbecco's phosphate buffered saline(DPBS)을 이용한 washing 과정을 1회 거친 다음 각 well당 10 ㎕의 CCK-8(Cell counting kit-8, Dojindo, 일본) 시약을 포함하는 배지로 교체하여 37 ℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 이후 UV-Vis spectrophotometer를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율(Cell viability)은 GQD를 포함하지 않은 배지를 처리한 경우를 대조군으로 하여 이의 평균 흡광도 값에 대한 백분율로 나타내었다.
[75]
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 GQD를 처리한 경우 세포증식을 저해시키지 않았고, 세포증식 촉진 효과가 있는 것을 확인하였다. 이를 통해 피부 세포에 1x10 5 ng/mL 이상으로 처리 시에도 세포 독성이 없다는 것을 확인하였다.
[76]
[77]
실험예 2 : 항산화 효능 평가
[78]
세포 내에서 발생하는 활성산소종(ROS)과 반응하여 형광을 띠는 DCF-DA를 사용하여, ROS 생성량을 확인함으로써 항산화력을 측정하였다. 섬유아세포주 Hs68을 6 well plate에 3.5x10 5의 수만큼 분주한 후, 37 ℃, 5% CO 2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS를 넣어준 후, Control을 제외한 나머지 세포군에 H 2O 2를 첨가한 뒤 24시간 동안 추가 배양하였다. 이후 빛을 차단한 상태에서 DCF-DA(10 μM)를 넣고, 37 ℃에서 1시간 염색하였다. 그 다음으로 배지를 제거한 후에 DPBS로 2회 washing한 후, well마다 1 ml DPBS를 넣고 cell scrapper로 긁어서 EP tube에 담았다. 이렇게 모은 cell 용액을 200ul씩 96 well black plate에 3회 반복하여 넣은 후, Ex/Em=485/535nm로 하여 Victor 3로 plate reading하였다. 하기 수학식 1과 같이 무처리군(None)에 대한 %를 계산하여 세포 내 ROS(intracellular ROS)를 측정한 결과를 도 2에 나타내었다.
[79]
[수식1]


[80]
[81]
그 결과, 100 ng/mL와 1000 ng/mL GQD 처리 농도에서 DCF-DA assay에 의한 GQD의 세포 내 ROS에 대한 항산화 효능이 있음을 확인하였다.
[82]
[83]
실험예 3 : 세포 내 OH 라디칼 소거능 평가
[84]
살아있는 세포 내의 OH 라디칼에 선택적으로 결합하여 형광을 띠는 OH580 probe를 첨가하여, 그래핀 양자점(GQD)의 OH 라디칼 소거능을 평가하였다. 섬유아세포주 HS68을 96 well plate에 2x10 4씩 분주한 후, 37 ℃ 5% CO 2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 plate를 800 rpm에서 2분간 원심분리한 후 배지를 제거하고 OH580 stain working solution(abcam, Massachusetts, USA)을 well마다 100 ul씩 처리한 후 호일로 싸서 37 ℃, 5% CO 2에서 1시간 동안 반응시킨다. 이후 DPBS에 H 2O 2(100uM)를 비롯한 그래핀 양자점을 각 10, 100, 1000 ng/ml에 맞게 처리 후, 2시간 동안 37 ℃, 5% CO 2에서 반응시킨다. 이후 Solution을 제거하고 DPBS로 2~3회 washing한 후, 100 uL의 Assay Buffer를 각 well에 넣고 형광 현미경으로 594 nm 파장에서 관찰한다.
[85]
섬유아세포 세포 내 H 2O 2 유도로 생성된 OH 라디칼 소거능을 형광 현미경으로 확인한 결과, 도 3과 같이 GQD를 10 ng/mL, 100 ng/mL, 1000 ng/mL 농도에서 처리한 경우 대조군과 비교 시 유의한 항산화 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
[86]
[87]
실험예 4 : 세포 재생 촉진능 평가
[88]
그래핀 양자점(GQD)의 세포 재생 촉진 효과를 평가하기 위해 실험예 1, 2에서와 동일 세포를 사용하여 실험을 진행하였다. Ascorbic acid 처리 세포를 양성 대조군으로 사용하였다.
[89]
Hs68 섬유아세포를 5x10 5 cells/well의 농도로 6 well plate에 분주한 후, 37 ℃, 5% CO 2 조건의 배양기에서 24 시간 동안 배양하여 100% confluent한 상태를 만들어 주었다. 이후 pipette tip을 이용하여 well의 가운데를 가로지르도록 임의로 긁어 상처를 내고, GQD를 포함하지 않은 배지와 각각 10 ng/mL, 100 ng/mL, 1000 ng/mL의 GQD를 포함하는 배지로 교체해 준 다음 24시간 동안 추가로 배양하였다. 24시간 후, GQD를 포함하지 않은 경우와 포함한 경우에서 세포에 임의로 낸 상처가 어느 정도 회복되었는지를 현미경으로 촬영하였다.
[90]
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 GQD를 처리하지 않은 경우에 비해 처리한 경우에서 세포 재생이 더욱 촉진됨을 확인하였다.
[91]
[92]
실험예 5 : MMP-1 저해능 평가
[93]
자외선에 의해 증가하는 콜라게나아제(MMP-1)에 대한 그래핀 양자점(GQD)의 저해능을 비교하기 위해 인간 섬유아세포주 Hs68을 이용하여 MMP-1 발현량 측정을 진행하였다. 섬유아세포주 Hs68을 6 well plate에 3x10 5의 수만큼 분주한 후, 37 ℃, 5% CO 2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS를 넣어준 후 UVB 비조사군을 제외한 나머지 세포군에 12 mJ/cm 2의 UVB를 조사한 뒤, GQD를 통도별로 첨가하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후 각 샘플을 처리한 세포에서 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop을 이용하여 260 nm에서 RNA를 정량한 후, 각각 2 ㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA에 타겟 단백질인 MMP-1 primer와 시아닌 염료인 사이버그린(SYBR Green supermis, Applied Biosystems, 미국)을 첨가한 혼합물을 이용하여 real-time PCR 기계에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 MMP-1 유전자의 발현 정도를 평가하였다. Primer의 서열과 반응 조건은 하기 표 1와 같았으며, 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.
[94]
[표1]
[95]
[96]
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 UVB 조사군에서 MMP-1 발현량이 급격히 증가한 것에 반해, GQD 처리군에서는 그 발현량이 감소하는 모습을 보였다.
[97]
[98]
실험예 6 : 주름 개선 효과
[99]
상기 도 2와 도 3의 결과에서 보인 항산화 효과들이 사람 피부에서 주름에 중요한 역할을 하는 콜라겐의 생성을 증가시키는지를 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 사람 섬유아세포를 6 well 세포 배양 접시에 4 X 10 5의 밀도로 접종한 후 37 ℃, 5% CO 2 배양기에서 24시간 배양하였다. UVB를 12 mJ/cm 2 조사한 후 GQD를 농도별로 처리하고 24 시간 동안 추가 배양하였다. 그 후 각 샘플의 세포에서 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop을 이용하여 260㎚에서 RNA를 정량하고, 각각 2㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA에 타겟 단백질인 procollagen primer와 시아닌 염료인 사이버그린을 첨가한 혼합물을 이용하여 real-time PCR 기계에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 type 1 procollagen 유전자의 발현 정도를 평가하였다. 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.
[100]
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 피부 세포에 GQD 처리시 type 1 procollagen 생성이 증가한 것을 확인하였으며, 또한 도 7에 나타낸 바와 같이 피브릴린 발현을 촉진한다는 것을 확인하였다. 이를 통해 그래핀 양자점이 피부 탄력 및 주름 개선 효과를 나타낼 수 있다는 것을 확인하였다.
[101]
[102]
실험예 7 : 보습 효과
[103]
그래핀 양자점(GQD)의 보습 효과를 확인하기 위해, 인간 섬유아세포에서 발생하는 히알루론산 합성 효소의 발현 정도를 Hyaluronic acid synthase-3(HAS-3)와 Aquaporin-3(AQP-3) 유전자 발현 측정을 통해 평가하였다.
[104]
세포를 6 well plate에 분주하고 배양 24시간 후, 인산 완충 식염수 용액(PBS)로 세척하고, 각 well에 FBS를 넣지 않은 DMEM 배지에 GQD를 10 ng/mL, 100ng/mL, 1000 ng/mL 농도로 첨가하였다.
[105]
그 결과, 도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, GQD 무처리 군에 비해 GQD를 처리한 각 세포에서 HAS-3(도 8)와 AQP-3(도 9) 발현 증가가 촉진한 것을 확인하였고, 이를 통해 GQD의 피부 보습 효과를 확인할 수 있었다.
[106]
[107]
< 실시예 2>
[108]
제조예 2: 그래핀 양자점을 포함하는 화장료 조성물의 제조
[109]
(1) 토너제의 제조
[110]
그래핀 양자점을 포함하는 화장료 조성물을, 하기 표 2에 나타낸 성분 및 함량에 따라 통상적인 방법을 통해 토너제로 제조하였다.
[111]
[표2]
[112]
[113]
(2) 로션제의 제조
[114]
그래핀 양자점을 포함하는 화장료 조성물을, 하기 표 3에 나타낸 성분 및 함량에 따라 통상적인 방법을 통해 로션제로 제조하였다.
[115]
[표3]
[116]
[117]
(3) 크림제의 제조
[118]
그래핀 양자점을 포함하는 화장료 조성물을, 하기 표 4에 나타낸 성분 및 함량에 따라 통상적인 방법을 통해 크림제로 제조하였다.
[119]
[표4]

청구범위

[청구항 1]
그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는, 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화용 화장료 조성물.
[청구항 2]
제1항에 있어서, 상기 그래핀 양자점은 화장료 조성물 총 중량 대비 1.0 × 10 -7 내지 30 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
[청구항 3]
제1항에 있어서, 상기 그래핀 양자점은, i) 활성산소 소거, ii) 콜라게나아제(MMP-1)의 발현 억제, iii) 타입 1 프로콜라겐(type 1 procollagen) 합성 촉진, iv) 피브릴린(fibrillin) 발현 증가, v) 히알루론산 합성 효소-3(HAS-3) 발현 증가, 또는 vi) 아쿠아포린-3(AQP-3) 발현 증가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효과를 제공하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
[청구항 4]
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 분체(powder), 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 향료, 친수성 또는 친유성 활성제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
[청구항 5]
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 토너제, 로션제, 및 크림제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
[청구항 6]
그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는, 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화용 의약외품 조성물.
[청구항 7]
그래핀 양자점을 유효성분으로 포함하는, 피부 재생, 주름 개선, 보습 또는 항산화용 약학 조성물.

도면

[도1]

[도2]

[도3]

[도4a]

[도4b]

[도5]

[도6]

[도7]

[도8]

[도9]